【聚合氯化鋁】

在污水處理中，由于硝化細菌是自養(yǎng)異養(yǎng)細菌且生長緩慢，容易流失，所以近年來固定化微生物技術的應用越來越受到人們的關注.固定化微生物技術是通過化學或物理的手段, 將微生物細菌限定于載體空間區(qū)域內(nèi)，保持其活性并且可以反復利用.與傳統(tǒng)生物處理法相比，固定化微生物技術具有微生物流失少、污泥產(chǎn)量少、抗沖擊負荷能力強等優(yōu)點，可以包埋預先篩選出的特種菌種，運用于污水處理系統(tǒng)中.目前，包埋固定化硝化細菌處理氨氮廢水成為國內(nèi)外學者的研究焦點.郝婧所用的包埋固定化硝化細菌處理高氨氮廢水，在反應溫度為28~30℃，pH為8.2，包埋顆粒體積填充率為25%的條件下，氨氧化速率*高約30 mg·(L·h)-1.利用固定化氨氧化細菌進行含氮廢水短程硝化時發(fā)現(xiàn)，溫度為30℃，pH為8.5時亞硝酸鹽氮積累率可達90%以上，氨氧化速率*高約為7.9 mg·(L·h)-1.Inoue等以聚乙烯醇為載體固定硝化細菌，填充率為50%時處理低溫氨氮廢水，硝化速率為17 mg·(L·h)-1.由此可見包埋硝化細菌處理氨氮廢水反應效率通常較低，且包埋后需嚴格控制反應條件，達到亞硝酸鹽氮的高積累.

因此，包埋硝化細菌實現(xiàn)短程硝化是可行的.但硝化細菌中氨氧化細菌含量較少，嚴重影響了硝化速率.為此，本實驗研究氨氧化細菌的包埋固定化.以水廠回流污泥為菌源，定向篩選AOB并淘汰NOB，以期達到細菌包埋完成后能實現(xiàn)較高的氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率.

1 材料與方法1.1 污泥來源與實驗裝置

實驗污泥取自北京高碑店處理廠硝化污泥.污泥富集培養(yǎng)連續(xù)流裝置見圖 1，反應池有效容積22 L.

圖 1 污泥富集培養(yǎng)裝置示意

污泥富集培養(yǎng)實驗采用人工模擬氨氮廢水，主要成分有: NH4Cl(投加量取決于NH4+-N濃度)，Na2CO3(投加量取決于NH4+-N濃度)，K2HPO4、KH2PO4(投加量取決于NH4+-N濃度，其中N:P為5)，MgSO4·7H2O(20mg·L-1)，CaCl2·2H2O(10mg·L-1).每升進水中加入0.5 mL微量元素，其中ZnSO4·7H2O(0.12 mg·L-1)，NaMoO4·2H2O(0.12mg·L-1)，CoCl2·6H2O(0.15mg·L-1)，MnSO4·H2O(0.12mg·L-1)，NiCl2·6H2O(0.120 mg·L-1)，CuSO4·5H2O(0.03mg·L-1)和FeCl3·6H2O(1.5 mg·L-1).

培養(yǎng)過程中反應溫度控制在25℃，DO為1~1.5 mg·L-1范圍內(nèi)，pH為8~8.4.實驗起始時MLSS為4 030 mg·L-1，MLVSS為2 473 mg·L-1，實驗過程中每天連續(xù)排泥.初期進水氨氮濃度為100 mg·L-1，后逐步提高至700 mg·L-1.水力停留時間由4 h縮短到2 h.

1.2 包埋填料的制備與應用

按照本實驗室成熟的包埋技術，取7 L富集培養(yǎng)后的污泥進行離心濃縮，加入膠狀體聚乙烯醇(PVA)混合制成包埋液，均勻涂裝在條狀載體上，包埋液中PVA與濃縮污泥的濃度分別為10%和25%.以硼酸和無水硫酸鈉為交聯(lián)劑交聯(lián)4 h.包埋連續(xù)流裝置同上，包埋填料填充率為8%.實驗采用人工模擬氨氮廢水，其構(gòu)成同上.實驗在室溫下進行，反應pH為7.2~8，DO為2~4 mg·L-1之間.實驗進水氨氮濃度由50 mg·L-1逐步提高至250 mg·L-1，HRT為4 h.為適應高碑店污水處理廠的實際進水氨氮濃度，在氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率穩(wěn)定后，降低進水氨氮濃度至30~40 mg·L-1，并縮短水力停留時間至2 h.

1.3 實驗分析方法1.3.1 高通量測序分析方法

取原始污泥混合液和富集培養(yǎng)后的污泥混合液分別標記為Yu01和Yu02，提取DNA并對樣本16S rRNA的V3-V4區(qū)域進行PCR擴增.

采用Illumina HiSeq2500 PE250高通量測序平臺對樣品進行測序.針對測序數(shù)據(jù)進行環(huán)境微生物的16S分析，首先對原始的paired-end reads進行過濾得到高質(zhì)量reads，然后通過序列拼接得到較長的序列，將其與16S參考數(shù)據(jù)庫作比對，同時去除嵌合體序列，*終將過濾后的序列按照一定的閾值進行歸類，得到多個序列聚類操作分類單元(OTUs)，設定閾值的序列相似性為0.97分為同一類，分成的一個類就是一個OTU，代表一個種.接著根據(jù)OTUs結(jié)果進行α多樣性的計算. α多樣性指標包括豐富度指數(shù)(ACE)、多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)、goods_coverage和observed_species等.其中豐富度衡量單個樣本中物種種類個數(shù)，實際通過估算OTU的個數(shù)來衡量;多樣性指數(shù)衡量群落的異質(zhì)性. goods_coverage表示樣品文庫的覆蓋率，即測序深度指數(shù)，其數(shù)值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低. Observed_species代表該樣品中OTU的個數(shù).

1.3.2 其他分析方法

NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測定;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定;NO3--N采用紫外分光光度法測定;pH采用SX711便攜式pH計測定;溶解氧采用JPSJ-605F型溶解氧儀測定.

2 結(jié)果與討論2.1 氨氧化細菌富集培養(yǎng)階段結(jié)果及分析2.1.1 進水氨氮濃度與污泥比氨氧化速率變化情況分析

從圖 2可以看出，反應起始階段(1~5 d)進水氨氮控制在100 mg·L-1，HRT為4 h，污泥比氨氧化速率開始由0.103 g·(g·d)-1緩慢增長至0.348 g·(g·d)-1.此時還處于活性恢復階段，為了提高污泥比氨氧化速率，從第6 d開始提高進水氨氮濃度并將HRT縮短為3 h.至第22 d，由于污泥比氨氧化速率增長較快，提高進水氨氮濃度至400 mg·L-1并同時縮短HRT至2 h并保持不變.

圖 2 污泥進水氨氮濃度及污泥比氨氧化速率變化

經(jīng)過30 d的富集培養(yǎng)，污泥比氨氧化速率呈對數(shù)增長至1.368 g·(g·d)-1.隨著污泥比氨氧化速率的不斷提高，在水力停留時間2 h內(nèi)出水氨氮濃度逐漸減小為零，此時反應較易向全程硝化轉(zhuǎn)化.所以繼續(xù)增加進水氨氮濃度至500 mg·L-1，此時污泥比氨氧化速率增長緩慢，說明高濃度氨氮對氨氧化細菌的活性有一定抑制作用.而后繼續(xù)增加進水氨氮濃度至700 mg·L-1，可以發(fā)現(xiàn)在短暫的適應期過后，污泥比氨氧化速率繼續(xù)增長，*終高達2.028 g·(g·d)-1.污泥比氨氧化速率的持續(xù)增長可以證明富集培養(yǎng)階段氨氧化細菌活性不斷增強.

2.1.2 污泥濃度變化情況分析

由于反應體系中始終保持著較高濃度的亞硝酸鹽氮，作為NOB的反應底物，亞硝酸鹽氮的積累對NOB的生長有一定的促進作用.為了將NOB徹底淘洗出去，實驗過程中每天不斷排泥.從圖 3可以看出，前23 d系統(tǒng)中MLVSS不斷增長，這是由于前期排泥量較小.為保持系統(tǒng)中穩(wěn)定的污泥濃度，第24 d開始加大排泥量，污泥濃度逐漸減小，至第35 d基本穩(wěn)定.盡管每天不間斷排泥，系統(tǒng)總污泥濃度仍不間斷增長，后由高通量測序可知污泥中氨氧化細菌大量增長.

圖 3 污泥濃度變化

2.1.3 污泥亞硝酸鹽氮積累率變化情況分析

從圖 4可以看出，反應起始階段(1~5 d)亞硝酸鹽氮積累率由33%迅速增長至70%.從第6 d開始提高進水氨氮濃度后，亞硝酸鹽氮積累率進一步增加至85%以上并逐漸穩(wěn)定.此后由于氨氮濃度不斷提高，F(xiàn)A對NOB的抑制作用不斷增大，且每天不間斷地排泥，致使NOB活性越來越低且數(shù)量越來越少.而此時氨氧化細菌大量增長且活性不斷增強，在系統(tǒng)中占有明顯的生態(tài)優(yōu)勢.這使得亞硝酸鹽氮積累率從第20 d起始終保持在90%以上.

圖 4 污泥亞氮積累率變化

本實驗進行至第60 d，污泥比氨氧化速率的高表達和亞硝酸鹽氮的高積累已達到預期效果，此時取污泥樣品進行高通量測序，結(jié)果表明氨氧化細菌已成為優(yōu)勢菌種，可以進行后續(xù)包埋實驗.另外，本實驗污泥富集培養(yǎng)階段出水用于反硝化實驗，脫氮后排放.

2.1.4 污泥多樣性及菌群變化分析

通過對兩組樣品16S rRNA基因文庫高通量測序，污泥原樣(Yu01) 與富集培養(yǎng)后的污泥樣品(Yu02) α多樣性指標計算結(jié)果見表 1.

表 1 α多樣性指標計算結(jié)果

由表 1可知，兩個樣品的文庫覆蓋率均大于0.98，表明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣本中所有的物種. Yu01的Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)大于Yu02，說明原污泥群落多樣性高于篩選后的污泥.多樣性指數(shù)較高的原始污泥群落各種之間個體分配較均勻，而篩選后的污泥各種之間生物量差異較大，優(yōu)勢種群明顯.

為了更深入研究系統(tǒng)的優(yōu)勢菌種，計算每個樣本在屬級的相對豐富度. 表 2、表 3列出了每個樣品前三類優(yōu)勢菌屬及與硝化作用相關的Nitrospira和Nitrosomonas所占百分比及系統(tǒng)分類.

表 2 Yu01優(yōu)勢菌屬

表 3 Yu02優(yōu)勢菌屬

與常規(guī)分子生物學手段相比，高通量測序可以提供更豐富的微生物信息.盡管如此，Yu01與Yu02仍有50.5%與51.4%的序列無法歸入已知細菌屬.原泥樣品菌群分布較均勻，均為廢水處理系統(tǒng)中的常見菌種.其中與硝化作用相關的為Nitrospira和Nitrosomonas.已知的Nitrospira菌屬為硝酸鹽氧化細菌，Nitrosomonas菌屬為氨氧化細菌，前者為后者的11.25倍.篩選后的污泥樣品中，Nitrosomonas成為優(yōu)勢菌，這與Wells等的研究結(jié)果一致，即絕大多數(shù)反應器中Nitrosomonas是AOB的優(yōu)勢菌種.而Nitrospira僅占系統(tǒng)的0.02%，此時Nitrosomonas是Nitrospira的900倍.

2.2 包埋氨氧化細菌短程硝化階段結(jié)果及分析2.2.1 包埋填料短程硝化效率與亞氮積累率變化情況

對包埋填料進行活性恢復.由圖 5可知起始階段系統(tǒng)進水氨氮濃度為50 mg·L-1，氨氧化速率由1 mg·(L·h)-1緩慢增加至6 mg·(L·h)-1.此時氨氧化速率較低，從第12 d起為提高反應速率將進水氨氮濃度增加至100 mg·L-1，可以發(fā)現(xiàn)隨著氨氮濃度的增加，氨氧化速率增長加快，至第19 d迅速增長至20 mg·(L·h)-1.因此，通過逐步增加進水氨氮濃度的方法提高氨氧化速率是可行的.此后繼續(xù)階段性地提高進水氨氮濃度至250 mg·L-1，氨氧化速率*可高達50 mg·(L·h)-1.

圖 5 包埋填料氨氧化速率變化

從圖 6可以看出，實驗過程中系統(tǒng)始終保持95%以上亞硝酸鹽氮積累率.證明系統(tǒng)中氨氧化細菌始終保持著**的生態(tài)優(yōu)勢.由此可以證明，包埋固定本實驗篩選后的氨氧化細菌有利于實現(xiàn)硝化系統(tǒng)中穩(wěn)定的亞硝酸鹽氮積累.

圖 6 包埋填料亞氮積累率變化曲線

2.2.2 模擬水廠進水氨氮濃度下的處理效果

為適應高碑店污水處理廠的實際進水氨氮濃度，在氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率穩(wěn)定后，降低進水氨氮濃度至30~40 mg·L-1.由圖 7、8可以看出，系統(tǒng)始終保持著90%以上的氨氮去除率以及亞硝酸鹽氮積累率.

圖 7 系統(tǒng)氨氮去除率變化

圖 8 系統(tǒng)亞氮積累率變化

3 結(jié)論

(1) 采用連續(xù)流運行方式逐步提高進水氨氮濃度，可以促進氨氧化細菌活性的增強并使之大量增長，從而大大地提高氨氧化速率，但高濃度氨氮對氨氧化細菌的活性有一定的抑制作用.具體參見資料或更多相關技術文檔。

(2) 固定化富集培養(yǎng)后的氨氧化細菌，反應器包埋填充率為8%時，氨氧化速率*高可達50 mg·(L·h)-1，亞硝酸鹽氮積累率穩(wěn)定在90%以上.

(3) 用包埋填料處理水廠模擬污水，氨氮去除率和亞硝酸鹽氮積累率均可保持在90%以上.

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